束縛應(yīng)激模型大鼠體重及生化指標(biāo)含量變化

應(yīng)激是機(jī)體受到各種內(nèi)外環(huán)境因素及社會(huì)、心理因素刺激引起的一系列全身性非特異綜合性應(yīng)答反應(yīng)，表現(xiàn)為下丘腦 － 垂體 － 腎上腺皮質(zhì)軸( HPA) 系統(tǒng)及交感神經(jīng) － 腎上腺髓質(zhì)系統(tǒng)的興奮，并伴有眾多組織和器官的功能變化［1］。應(yīng)激動(dòng)物模型的建立是研究應(yīng)激的基礎(chǔ)，慢性束縛應(yīng)激動(dòng)物模型已被證明是一種能引起典型非特異應(yīng)激表現(xiàn)的有效方法，其可以通過(guò)剝奪動(dòng)物活動(dòng)自由而產(chǎn)生純粹的挫 折應(yīng)激，這種應(yīng)激造成模型動(dòng)物心理緊張狀態(tài)，傾向  于通過(guò)非特異性的心理和生理反應(yīng)表現(xiàn)出來(lái)，應(yīng)激 時(shí)眾多神經(jīng)***功能發(fā)生變化，從而造成**功 能低下，而且束縛應(yīng)激能抑制動(dòng)物體重增加［2 － 3］。縛 應(yīng) 激 與 人 類 心 身 性 疾 病 過(guò) 程 相似，同時(shí)又適應(yīng)應(yīng)激領(lǐng)域由急性轉(zhuǎn)入慢性的發(fā)展趨勢(shì)，被泛用于抑郁癥的相關(guān)研究。

本實(shí)驗(yàn)?zāi)M慢性束縛應(yīng)激過(guò)程，觀察大鼠慢性 束縛應(yīng)激不同時(shí)間體重及血清中皮質(zhì)酮( CORT)  ， 去甲腎上腺素 ( NE) ，熱休克蛋白 70 ( HSP70) 、白介素 2 ( IL － 2) 和白介素 4 ( IL － 4) 的變化，探討慢性束縛應(yīng)激不同時(shí)間對(duì)動(dòng)物體重、**功能及神經(jīng) 遞質(zhì)的影響，為心理應(yīng)激功能研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)和 理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1． 1 實(shí)驗(yàn)對(duì)象與試劑

雄性清潔級(jí)  Wistar  大鼠 30  只，6  周齡，體重  ( 90 ± 3) g 購(gòu)于大連醫(yī)科大學(xué)SPF 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心［合格證編號(hào):  SYXK (  遼)  2008  － 0002 ］;  CORT、NE、

HSP70、IL － 2 和 IL － 4 酶聯(lián)**檢測(cè)試劑盒購(gòu)于Abcam 公司; 其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純; 酶標(biāo)儀為Thermol 公司產(chǎn)品; 固定器為北京智鼠多寶生物科技有限公司產(chǎn)品。

1． 2    動(dòng)物分組

大鼠適應(yīng)環(huán)境 7 d 后隨機(jī)分為 3 組: 正常對(duì)照組( C) 、束縛 3 周組( R3) 和束縛 5 周組( R5) ，每籠5 只，飼養(yǎng)于清潔級(jí)動(dòng)物房。室內(nèi)溫度保持為( 22 ±2) ℃ ，相對(duì)濕度保持為 30% ～ 40% ，各組大鼠常規(guī)飼料，自由進(jìn)食飲水，并每日觸摸動(dòng)物以適應(yīng)實(shí)驗(yàn)人員的操作。

1． 3    處理方法

除正常對(duì)照組外，每天早 9: 00 將大鼠置于不能自由活動(dòng)的固定器內(nèi)，連續(xù)束縛 6  h，1 次/ d，連續(xù)束縛 3 周或 5 周。束縛時(shí) 3 組大鼠均禁食禁水，應(yīng)激大鼠不受擠壓無(wú)損傷，不影響呼吸和排泄，但運(yùn)動(dòng)受限。首先對(duì) R5 組大鼠進(jìn)行束縛，2 周后對(duì) R3 組大鼠進(jìn)行束縛。

1． 4    體重稱量

大鼠稱重均在早上進(jìn)行，所有大鼠在束縛前 1 天和束縛結(jié)束后第 2 天均進(jìn)行 1 次體重測(cè)量。

1． 5    生化指標(biāo)測(cè)定

各組大鼠在束縛應(yīng)激結(jié)束后第 2 天，眼球靜脈采血 2  mL，室溫靜置 2  h，待血液凝固后于 4℃  3000 r / min 離心 20  min，分離血清，并置于 － 80  ℃ 保存待測(cè)。采用 ELISA 法檢測(cè) CORT、NE、HSP70、IL － 2 和IL － 4 的含量，測(cè)定時(shí)所有樣品用生理鹽水稀釋 10 倍，具體操作過(guò)程嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

1. 6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

SPSS11． 5 統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果用均數(shù) ± 標(biāo)準(zhǔn)差( x ± s) 表示，差異檢驗(yàn)用方差分析和 t 檢驗(yàn)，P ＜ 0． 05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2. 1 行為變化

隨著束縛時(shí)間的延長(zhǎng)，大鼠發(fā)生明顯的行為變化，與 C 組比較，束縛組大鼠進(jìn)食量減少、行為遲緩、長(zhǎng)期站立不動(dòng)、尖叫、不斷的淌淚、皮毛和面部不潔、毛須豎立、目光呆滯。

2. 2 體重變化

慢性束縛應(yīng)激顯著抑制大鼠體重增加，與 C 組相比，R3 組和 R5 組大鼠分別顯著降低了 29． 94%和 33． 23% ( P ＜ 0． 05) ，且隨著束縛時(shí)間延長(zhǎng)，大鼠體重抑制越明顯，R5 組大鼠比R3 組降低了14． 57% ( P ＜ 0． 05) ，見(jiàn)表 1。

2． 3 生化指標(biāo)變化

慢性束縛應(yīng)激可使大鼠血清 CORT 含量升高， 與 C 組相比，R3 組和 R5 組分別升高了 11． 25% 和46． 65% ( P ＜ 0． 05) ，且具有時(shí)間依賴性，隨著束縛時(shí)間延長(zhǎng)，含量升高越明顯，R5  組含量比 R3  組升高了 31． 82% ( P ＜ 0． 05) 。慢性束縛應(yīng)激后，R3 組和 R5 組 NE 含量比 C組分別顯著升高了 25． 16%  和 39． 09% ( P ＜ 0． 05) ，且具有時(shí)間依賴性，隨著束縛時(shí)間延長(zhǎng)，升高越明顯，R5 組比 R3 組升高了11． 13% ( P ＜ 0． 05) 。

R3 組和 R5 組與 C 組相比 HSP70 含量分別升高了 5． 15% ( P ＞ 0． 05)  和13． 49% ( P ＜ 0． 05 ) ，R5組含量比 R3 組升高了 7． 93% ( P ＜ 0． 05) 。與 C 組 相 比 ， 慢 性 束 縛 應(yīng) 激 后 R3 組 和R5 組 IL － 2含量分別降低了 15． 43% 和 16． 01( P ＜0． 05) ，但不具有時(shí)間依賴性，隨著束縛時(shí)間延長(zhǎng)，其含量并沒(méi)有明顯降低。慢性束縛應(yīng)激后大鼠血清中 IL － 4 含量升高，R3 組和 R5  組分別升高了9． 86% 和 18． 69% ( P ＜0． 05) ，且具有時(shí)間依賴性，R5  組比 R3  組升高了8． 04% ( P ＜ 0． 05) 。見(jiàn)表 2。

3 討 論

應(yīng)激抑制大鼠體重增長(zhǎng)的原因可能歸結(jié)于皮質(zhì)酮( COPT) 升高，皮質(zhì)酮可以增加機(jī)體對(duì)胰島素的敏感性、減少食物的攝入量而導(dǎo)致體重減輕，而且皮質(zhì)酮還可促進(jìn)蛋白質(zhì)分解，抑制其合成，同時(shí)也影響糖類和脂類的代謝，這些*終導(dǎo)致體重增長(zhǎng)緩慢［4］。本研究在束縛過(guò)程中發(fā)現(xiàn)束縛組大鼠進(jìn)食量減少，根據(jù)行為變化和體重變化初步確定造模成功。

本研究中，束縛應(yīng)激導(dǎo)致了大鼠血清 CORT 升高，且束縛時(shí)間越長(zhǎng)，對(duì)大鼠損害越明顯。因?yàn)閼?yīng)激主要激活 HPA 軸，老鼠受到束縛后，由于激怒，使得交感神經(jīng)興奮，下丘腦分泌的促腎上腺皮質(zhì)**釋放因子( CRH) 經(jīng)垂體門脈系統(tǒng)進(jìn)入垂體前葉，促使促腎上腺皮質(zhì)**( ACTH) 產(chǎn)生，此**作用于腎上腺皮質(zhì)，使之分泌大量的糖皮質(zhì)**( GC，皮質(zhì)醇和皮質(zhì)酮) ，*終發(fā)揮生物學(xué)作用，而 GC 的分泌反過(guò)來(lái)又抑制 ACTH 和 CRH 的釋放，形成負(fù)反饋機(jī)制，而且 GC 水平升高，導(dǎo)致海馬神經(jīng)元內(nèi)糖皮質(zhì)**受體( GR) 受損，密度下降，進(jìn)而 HPA  軸脫抑制［5 － 8］。NE 是由腎上腺髓質(zhì)分泌的一種兒茶酚胺**， 屬于一種單胺類神經(jīng)遞質(zhì)。單胺類神經(jīng)遞質(zhì)是一類 調(diào)節(jié)機(jī)體生理活動(dòng)的重要物質(zhì)，許多實(shí)驗(yàn)證明，單胺  類神經(jīng)遞質(zhì)在應(yīng)激狀態(tài)下有所改變，還有研究表明 大鼠抑郁樣行為可能與 NE 含量升高對(duì)色氨酸代謝影響有關(guān)［9］。CORT 和NE 是研究的比較多的指標(biāo)， 本研究結(jié)果與前期報(bào)道一致。

目前普遍認(rèn)為外周血清 HSP70 能體現(xiàn)機(jī)體的應(yīng)激程度，慢性束縛引起大鼠血清 HSP70 濃度顯著升高，提示慢性束縛對(duì)機(jī)體是損傷性因素［10］。熱休 克蛋白 HSP70 是一種進(jìn)化上高度保守的應(yīng)激蛋白， 細(xì)胞內(nèi) HSP70 主要參與細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的折疊、裝配、降解和修復(fù)過(guò)程，調(diào)節(jié)蛋白活性，介導(dǎo)蛋白轉(zhuǎn)運(yùn) 和維護(hù)蛋白的自穩(wěn)系統(tǒng)等。正常情況下大多數(shù)組織 細(xì)胞內(nèi)其含量很低，當(dāng)機(jī)體遭受各種生理、病理或心 理應(yīng)激時(shí)表達(dá)會(huì)明顯增加［11］。運(yùn)動(dòng)應(yīng)激能夠誘導(dǎo)機(jī)體 HSP70 生成，HSP70 的適度增加可增強(qiáng)機(jī)體的適應(yīng)能力，從而成為一種保護(hù)機(jī)制，HSP70 具有抗氧化的生物活性，對(duì)應(yīng)激有較強(qiáng)的抵抗作用［12 － 13］。本研究中，小鼠束縛 5 周后，HSP70 明顯升高。

IL － 2 主要由活化的 T **細(xì)胞產(chǎn)生，能維持 T **細(xì)胞在體外的生長(zhǎng)，并激活多種**細(xì)胞，還可以活化 NK 細(xì)胞、B **細(xì)胞，分泌抗體，是調(diào)節(jié)機(jī)體**功能*主要的細(xì)胞因子之一，其水平反映了 T 細(xì)胞的功能狀態(tài)［14 － 15］。本研究中，慢性束縛降低了大鼠血清 IL － 2 含量，說(shuō)明束縛應(yīng)激使大鼠的**功能受到抑制，與前期報(bào)道一致［14 － 16］。

IL － 4 具有調(diào)節(jié)**應(yīng)答、急性期反應(yīng)、并參與機(jī)體炎癥反應(yīng)的抗感染防御作用，同時(shí)具有激活HPA 軸的作用，而且許多研究報(bào)道，束縛應(yīng)激能使HPA 軸功能亢進(jìn)［17］。但關(guān)于束縛應(yīng)激與IL － 4關(guān)系的研究鮮有報(bào)道。本研究中，慢性束縛后，大鼠血清IL － 4 含量升高。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明: 慢性束縛應(yīng)激可抑制大鼠體重增長(zhǎng)，改變血清中 CORT、NE、HSP70、IL － 2 和IL － 4的含量，可成為重要的分子靶標(biāo)，為各種相關(guān)心身性**的防御和**提供分子生物學(xué)基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。